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據估計，全世界每年有2.2 萬的骨科、神經外科及口腔科患者因骨缺損行骨移植手術。目前常見的骨移植材料有自體骨、同種異體骨、脫礦化骨基質、異種骨、合成材料、組織工程產品等。自從滅活骨、脫鈣骨能夠誘導異位骨再生的現象被發現以來，科學家們認識到蛋白在誘導骨再生中起到關鍵作用，基于生物活性分子的骨組織工程成為研究的熱點。骨是高度血管化的組織，血管生成對骨再生至關重要。缺乏血管生成會導致骨再生中骨形成和骨總量減少。新生的血管對于營養供應、分子信號的傳輸和干細胞的運輸十分重要。血管生成對骨再生的意義重大，眾多學者嘗試利用促進血管生成的因子與骨再生的因子結合共同促進骨愈合。本研究試圖利用VEGF與BMP-2制備基因活化的仿生生物材料，觀察其對骨缺損的愈合中的促進作用。
1 資料與方法
1.1實驗分組 實驗分為5個組，包括：純殼聚糖/膠原支架，記為G1（group 1）；整合BMP-2腺病毒的殼聚糖/膠原支架，記為G2（group 2）；整合VEGF腺病毒的殼聚糖/膠原支架，記為G3（group 3）；整合BMP-2腺病毒和VEGF腺病毒的殼聚糖/膠原支架，記為G4（group 4）；以及整合BMP-2腺病毒和VEGF蛋白的殼聚糖/膠原支架，記為G5（group 5）。
1.2殼聚糖膠原支架的制備及復合病毒 將殼聚糖用0.5mol/L乙酸配成2%（w/v）的溶液，將膠原按2%比例溶解于殼聚糖溶液中，磁力攪拌48h后注入培養皿，4℃ 下放置30min，-35℃放置過夜，最后-80℃放置2h成型后移入冷凍干燥機凍干，48h后干燥完成。支架在接種細胞或病毒前需滅菌，具體步驟如下：先以0.3M NaOH的溶液中和材料中的乙酸，然后75%乙醇浸泡12h，大量PBS沖洗去除殘余乙醇，紫外線照射30min。
將殼聚糖/膠原支架切塊。在無菌操作臺內，將病毒液滴于支架上，使之浸潤，具體量為：對于G2，G3組，1ml 的腺病毒溶液滴到1mg 的干燥的殼聚糖/膠原支架上，4℃ 過夜使支架與質粒或腺病毒充分結合，然后-80℃放置2h成型后移入冷凍干燥機干燥。對于G4組， Ad-BMP-2與Ad-VEGF病毒液等體積混合后，吸取1ml滴到1mg殼聚糖/膠原支架上，4℃ 過夜使支架與質粒或腺病毒充分結合，然后-80℃放置2h成型后移入冷凍干燥機干燥。對于G5組，將2mg VEGF-D蛋白溶解于2ml的滅菌的去離子水中，獲得的終濃度為濃度為1mg/ml，將2ml溶液滴于干燥的殼聚糖/膠原支架上，再將1ml 的Ad-BMP-2病毒溶液滴到1mg 的干燥的殼聚糖/膠原支架上，所獲得的支架為每1mg 支架有2mg VEGF蛋白及1mlAd-BMP-2病毒液；4℃ 過夜使支架與質粒或腺病毒充分結合，然后-80℃放置2h成型后移入冷凍干燥機干燥（圖1示冷凍干燥機及干燥過程）。
1.3整合不同生長因子的支架對骨髓間充質細胞增殖分化影響的相關研究 MTT 法檢測支架材料對骨髓間充質細胞增殖的影響。將五種支架各選4 塊置于24孔板內，第四代骨髓間充質細胞消化后，以1×105 細胞的密度接種于支架，每個支架100μl細胞懸液。3h后添加 150μl 10%FBS 的DMEM培養液繼續培養，分別在1、3、7d 檢測細胞增殖活性。
ALP檢測：接種方法同前，3 h后添加 900μl 10%FBS 的DMEM 培養液繼續培養，分別在7d和14d 檢測ALP活性。具體方法如下：7和14d后，取上清液，80μl的上清加20μl的0.5M的AMP，然后加入100μl底物，混勻后37°孵育1h。取50μl上清，按堿性磷酸酶試劑盒說明書在405nm波長下測ALP活性。根據換算出的每孔細胞的ALP值和DNA的總量的比值來計算每孔細胞的ALP活性，單位是nmoles paranitrophenol/ng DNA/min。
1.4骨缺損修復的觀察 選取 6 只2歲大的中華田園犬，手術在全麻下進行。局部消毒后，拔除下頜前磨牙，清理牙槽窩后，去除牙槽間隔，以得到骨缺損模型。植入種植體，將支架放入近中牙槽窩，縫合。將G1-G5組每組中的一個樣本隨機置于種植體近中缺損區，以保證每只狗都含有5個組的樣本。術后肌肉注射抗生素（40萬單位/ml，0.1ml/kg體重），動物軟食2w。12w時取材，截取下頜骨種植體周圍缺損區骨，低速渦輪機及去離子水沖洗冷卻下分割標本，進行組織學觀察。
2 結果
2.1 材料制備。
2.2通過MTT法檢測支架材料對骨髓間充質細胞增殖的影響。第四代骨髓間充質細胞三維培養于支架材料中后，分別在1、3、7d檢測，每組每個時間點檢測四個樣品。結果顯示（圖2），復合病毒或/和生長因子蛋白的殼聚糖/膠原支架與殼聚糖/膠原材料對骨髓間充質細胞的增殖沒有影響，病毒或/和生長因子蛋白對骨髓間充質細胞的增殖無毒性作用。
2.3 ALP活性是細胞成骨向分化的標記。骨髓間充質細胞在各組復合支架上三維培養時的ALP活性如圖3所示，7d和14d培養后，培養于復合Ad-BMP-2的支架上的骨髓間充質細胞均表現出較高的ALP活性（P
2.4組織學染色 組織學切片觀察種植體周圍的組織形態，圖4可見，種植體周圍均形生成了成熟的骨組織，骨組織中均有新生成的血管。定性觀察發現，G3與G4組新生成的血管較其他組高，G2，G4及G5組的骨生成多于G1，G3組，以G5組最高。
3 討論
骨缺損修復是復雜的生理過程，一般涉及到細胞遷移、增殖與分化以及骨重建[1]。通常骨形成可通過兩種不同的方式：假如骨斷端是固定的，或者在發育階段顱面部骨形成過程中，在將要形成骨的部位間充質前體細胞直接分化為骨細胞成骨，成為膜內成骨；若發生在有動度骨折斷端間，或者發育過程中的長骨和腰椎，則先形成軟骨稱之為軟骨化骨。新生血管提供營養和氧氣的供應，同時為血液循環中的間充質細胞提供途徑到達缺損區，以及增加骨細胞的增殖分化而起作用，在骨折愈合的初期十分重要 [2]。VEGF是主要的血管生成因子[3]。它在出生后的血管生成起到重要的作用。VEGF對肥厚性軟骨結構和血管化都十分重要。眾多研究發現，VEGF 單獨不能促進成骨[4，5]，已有研究證實VEGF與BMPs聯合使用能促進細胞存活率[6]，誘導成骨細胞增殖與分化[7]，以及促進骨細胞遷移[8]，通過這種方式促進了骨的再生。眾多學者在動物模型中聯合應用VEGF 與BMP-2促進骨再生，總的來說，大多數因子的聯合使用較單獨使用能增加成骨，單獨使用VEGF 不足以促進成骨，聯合使用VEGF能促進骨再生中的血管再生，這與本研究結果一致。有研究指出，在骨折愈合中，血管發生發生在成骨之前[9]。因此，開發一種模擬內源性基因釋放的這種呈時間特異性表達的基因控釋系統對骨組織工程意義十分重大。
由于VEGF在骨再生中有多種作用， VEGF除了促進成骨細胞的存活，它還能誘導血管再生。VEGF刺激內皮的增殖與遷移，并參與祖細胞的招募及分化為內皮細胞[10，11]。高劑量的VEGF已被證實能導致血管通透性的增加，并在骨再生中誘導產生大量的非生理性的內皮細胞管腔[12]。
研究者已經成功復合了殼聚糖/膠原支架。對于復合支架來說，殼聚糖的加入能降低細胞介導的收縮率，即在培養細胞的過程中，復合材料的收縮度比單純膠原支架的收縮率小，材料的機械性能有所增強。細胞在復合支架中更容易黏附，生長并增殖。分析是因為膠原成分的加入在四個方面提高了材料的細胞相容性：其一，降低了復合材料的孔徑，增大了材料的細胞容積；其二，增大了復合材料的吸水性，使細胞在支架中更容易交換營養與代謝物；其三，膠原本身可作為細胞營養的來源；其四，降低了材料的降解性能，使細胞更容易滲透到支架內部生長繼而引發進一步的支架降解。總的來說，本實驗制備了一種基因控釋支架，通過冷凍干燥法使生長因子與腺病毒結合，腺病毒介導的外源性基因能高效表達，在缺損區局部釋放，避免了腺病毒導致的免疫反應，在骨再生中具有潛在的應用前景。
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